マイクロエンジニアリングされたデバイスにより、長期間の使用が可能になります

Nature Communications volume 13、記事番号: 5006 (2022) この記事を引用

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95 オルトメトリック

メトリクスの詳細

神経回路のダイナミクスと接続性は、ミリ秒から動物の生涯にわたるタイムスケールで継続的に変化します。したがって、生物学的ネットワークを理解するには、行動する動物の生物学的ネットワークを繰り返し記録する、侵襲性を最小限に抑えた方法が必要です。ここでは、成体キイロショウジョウバエの腹側神経索 (VNC) の長期光学記録を可能にする一連のデバイスについて説明します。これらは、胸部外骨格を置換するための番号が付けられた透明な窓、内臓を移動させるためのコンプライアントインプラント、移植を補助するための精密アーム、およびハエを繰り返し繋ぎ止めるためのヒンジ付きステージで構成されています。私たちのツールキットを検証し説明するために、(i) 動物の行動と生存に対する最小限の影響を示し、(ii) 脚切断後の数週間にわたる弦音器官の機械感覚神経終末の劣化を追跡し、(iii) カフェイン摂取による神経活動の波を明らかにします。したがって、当社の長期イメージングツールキットは、損傷、薬物摂取、老化、学習、疾患に応じた運動前および運動回路の適応の研究を可能にします。

神経組織は非常に可塑性があり、内部状態の変化に適応し、顕著な環境信号に繰り返しさらされることに応答します。神経科学では、記憶形成や神経変性などの長いタイムスケールの現象の生理学的研究は、多くの場合、複数の時点でサンプリングされた動物間でプールされたデータの比較に依存してきました。ただし、このアプローチで条件間の差異を定量化するには、個人間のばらつきが伴います。したがって、同じ動物の長期記録は、神経回路の機能的および構造的ダイナミクスの適応変化を明らかにするのに理想的です。個々の動物で長期研究を行うには、実験的損傷を最小限に抑えるなど、重要な技術的課題を克服する必要があります。

顕微鏡ベースの神経記録、特に二光子カルシウムイメージング 1 の出現により、慢性デバイスを活用することで低侵襲な方法で生体内で脳回路を慢性的に記録することが可能になりました。たとえば、頭蓋窓技術は最初マウス新皮質 2 を研究するために開発され、その後、より大きく 3 より深い 4 撮像視野と、より長時間の記録を取得できるように改良されました 5。げっ歯類と同様に、脳イメージングは、行動する成虫のハエであるキイロキイロキイロショウジョウバエでも行うことができます6,7。このモデル生物は、(i) 遺伝的に扱いやすく、(ii) げっ歯類よりもニューロンがはるかに少ない小さな神経系を持ち、( iii) 複雑な社会的行動、ナビゲーション行動、および運動行動を生成します8、9、10、11。

最近のアプローチにより、ハエの脳のニューロンの長期にわたる慢性的な記録が可能になりました12、13、14。頭蓋窓を使って齧歯動物の新皮質を画像化するのと同様に、ハエの脳は、頭部被膜の表皮とその下にある組織を除去することによって光学的にアクセスできるようにすることができる6。長期間または繰り返しのイメージングを実行するには、この穴を UV 硬化性接着剤 13、2 成分シリコン 16、または手動でカットしたカバーガラス 12 で覆うことができます。しかし、マウスやハエの脳の長期イメージングに使用される技術や技術は、哺乳類の脊髄や昆虫の腹側神経索（VNC）の運動回路を記録するのには適していません。椎骨、筋肉、背側板で覆われている脊髄と同様に、VNC に光学的にアクセスするには、飛翔筋、脂肪体、腸、気管など、上に重なっている複数の器官や組織を除去する必要があります。脊髄の侵襲的手術では、チャンバー 18 またはクランプ 19 の移植が可能です。しかし、ハエのサイズが小さいため、従来の埋め込み型デバイスの使用は制限されており、実験的に扱いやすいVNC（哺乳類の脊髄のように粗く組織化された神経組織）の研究を通じて運動制御の一般原理を解明するという重要な課題となっている20。その制御原理は脊椎動物で見られるものと似ています 21,22。

我々は最近、外科的および遺伝学的に（間接飛翔筋の場合）上にある組織を除去することにより、繋がれた行動動物の VNC への光学的アクセスを可能にする解剖アプローチを開発しました 23。ただし、この技術は侵襲的であり、胸部臓器の切除が必要であり、イメージング中に胸腔を開いたままにしておく必要があります。これにより、数時間を超える録音ができなくなります。その結果、前運動回路と運動回路を同じ飛行で繰り返し測定して、これらの回路が時間の経過とともにどのように適応するかを明らかにすることは不可能でした。長期脳イメージング用の既存のツールは、長期 VNC イメージングには不十分です。脳画像処理とは異なり、解剖後に胸腔を覆うためにカバースリップを接着したり 13 したり、手動でカバースリップ 12 を切断したりすることはできません。その代わりに、血リンパが胸部から漏れないようにする、より正確で再現可能なアプローチが必要です。さらに、VNC への光学的アクセスを得るには、その機能を中断することなく、上にある大きな胸部器官および組織を静かに、しかししっかりと移動させる必要があります。

ここでは、ショウジョウバエ VNC の 1 か月以上の長期繰り返し記録を可能にするこれらの課題すべてに対処する一連のマイクロエンジニアリングデバイスについて説明します。これらのデバイスは、非常に穏やかな操作を必要とする小型モデル生物 (ハエの長さは約 2 ～ 3 mm) の研究に伴う特有の課題に対処します。具体的には、(i) 脇に移動して胸部臓器を一時的に所定の位置に保持できるマニピュレーター (「アーム」)、(ii) VNC への光学的アクセスを得るために胸部臓器を外科的に除去する必要性を排除する柔軟なインプラント、 (iii) 胸腔を囲み、イメージングセッション全体で個々のハエを互いに区別できるように番号が付けられた透明なポリマー窓、および (iv) 繰り返し記録するためにハエを優しくしっかりと繋ぎ止めるための再取り付けステージ。他の研究室での複製や採用を容易にするために、これらすべてのツールの製造方法と使用方法について詳しく説明します。

私たちは、インプラントと窓が動物の生存と移動に最小限の影響を与え、少なくとも 1 か月にわたる神経記録を可能にすることを実証します。次に、2 つの概念実証研究で長期イメージングツールキットの使用例を説明します。まず、脚切除後 2 週間の VNC の脚機械感覚ニューロン神経支配の劣化を縦断的に測定します。次に、胸部臓器を無傷のままにすることで、薬物摂取が神経集団の動態に及ぼす影響をどのように測定できるかを説明します。したがって、当社の長期胸部イメージングツールキットは、運動前回路および運動回路における構造的および機能的神経力学の反復的かつ長期的な研究を可能にします。これらのツールは、より一般的には、間接飛行筋、腸、気管などの他の胸部組織の研究にも使用できます。

私たちは、ハエの VNC への 1 か月以上の光学的アクセスを可能にするマイクロエンジニアリングデバイスと関連するマイクロマニピュレーションプロトコルを開発しました。移植されたハエは、摂食、歩行、産卵、または他者との交流の能力に明らかな欠陥を示しません。 (図 1a および補足ムービー 1)。光学的アクセスは、2 つの主要なコンポーネント、つまり、柔軟で透明なインプラント (図 1b) と透明な胸部窓 (図 1c) に依存します。窓の製造は再現可能でなければならず、血リンパの漏出を防ぐために胸部開口部をしっかりと密閉するのに十分な大きさでなければなりません。 UV 硬化性接着剤 13 や手動でカットしたカバーガラス 12 で封止するなど、長期の脳イメージング用に開発されたソリューションは、これらの課題には対処していません。フォトリソグラフィーにより、生体適合性ポリマーSU-8を使用してカスタムウィンドウを設計および微細加工しました（補足図1）。インプラントは長期の脳イメージングには必要ないため、以前のアプローチからインスピレーションを得ずに新たに設計する必要がありました。私たちの初期のインプラントは、VNCイメージング関心領域（ROI）を胸部組織による閉塞から保護することを目的とした剛性構造でした（補足図2、「反復1および2」）。その後の反復では、胸部窓と保護柱を組み合わせることが試みられました（補足図2、「反復3および4」）。しかし、これらの初期プロトタイプは両方とも、生存率が法外に低かった。私たちは、まったく異なるアプローチをとることで画期的な進歩を遂げました。つまり、コンプライアントな（ポリマーベースの）機械的に圧縮可能な V 字型インプラントを設計したのです。数回の反復とテストを通じて、これらのインプラントの特定のサイズと角度に到達し、その結果、非常に高いインプラント後の生存率が得られました。これらのインプラントは、ラピッドプロトタイピングとレプリカ成形に基づいた技術であるソフトリソグラフィーを使用して一括で製造しました（補足図3および4）。

a 移植された成虫ハエは複雑な環境でも飼育できます。移植された動物 -- 背側胸部窓 (黒い矢印) を参照 -- は移植されていない動物と相互作用します。スケールバーは0.5mmです。 b Ostemer 220 から微細加工された機械的に準拠した透明なインプラント。スケールバーは 50 μm。 c SU-8 から微細加工された、番号が付けられた透明な胸部窓。スケールバーは50μmです。 d 移植の場合、動物は、解剖段階内の鋼製シムの穴に、胸部から先に取り付けられます。 e 多段階の切開により、腹側神経索 (VNC) への長期にわたる光学的アクセスが可能になります。左背側胸部表皮に穴が開けられ、腹側神経索 (VNC、濃青色) を覆う前胃 (黄色)、気管 (シアン)、および唾液腺 (マゼンタ) が露出します。間接飛行筋 (IFM) は、Reaper (Act88F:Rpr) の組織特異的発現によって分解されました 23。次に、カスタム設計のマニピュレーターアームを使用して胸部臓器を移動し、VNC を明らかにします。次に、インプラントがこの胸腔内に狭く、機械的に閉じられた構成で配置されます。右腕が取り外され、インプラントが解放され、インプラントが開き、VNC を覆っている臓器を機械的に押しのけます。最後に、胸腔を囲むように透明な窓が密閉されます。 f 3D ナノプリントされた再取り付けステージにより、動物の取り付けと取り外しを繰り返して 2 光子イメージングを行うことができます。左モノリシック機構はコンプライアントヒンジを中心に作動します。右再搭載ステージに繋がれた動物を上から見たサンプル画像。 g 再装着ステージに繋がれた移植動物を、カメラアレイに囲まれた二光子顕微鏡の下に置きます。この構成により、神経活動と動物の行動を同時に記録できます。挿入図は、DeepFly3D25 を使用して推定された深層学習ベースの 2D ポーズが重ね合わされた 1 台のカメラ画像を示しています。 h (上の行) 解剖顕微鏡から見た、移植された動物の背側胸部、および (下の行) 二光子顕微鏡を使用して視覚化したその VNC。この動物は神経系全体で GFP を発現しており、左 3 dpi、中央 14 dpi、右 28 dpi で記録されます。 Z スタックは深さが色分けされています (100 μm)。スケールバーは25μmです。

これらのツールを使用するために、補足ムービー 2 に示す操作プロトコルを開発しました。簡単に説明すると、まず UV 硬化性接着剤を使用して動物を外科解剖ステージにマウントします (図 1d)23。次に、30G 注射針を使用して背側キューティクルに四角形の穴を開けます (図 1e - 左パネル)。その後、間接飛翔筋 (IFM) を除去して、インプラント用の胸部開口部を作成します。顕微手術の影響を最小限に抑えるために、私たちは、特に IFM (Act88F:Rpr) でアポトーシス誘導タンパク質である Reaper を発現する動物を研究しています。 Reaper を発現させると筋肉組織が急速に分解され 23、筋肉組織の残りは注射針で簡単に除去できます。ただし、この遺伝子系統は、これらのツールを使用するために厳密に必要とされるわけではありません。胸部組織を露出させた後、細いガラス針と鉗子を使用して、腸と左唾液腺をつなぐ気管線維を片側から剥離します。内臓（腸、唾液腺、気管）を胸腔の右側に押し込むためのカスタム操作アーム（補足図5）を設計しました（図1e - 左パネル）。これにより、インプラントを閉じた状態で新たにアクセス可能な胸腔に挿入することができます（図1e - 中央パネルおよび補足図4）。解放すると、操作アームが後退した後、インプラントが徐々に開き、臓器を胸壁に押し付けた状態になります（図 1e - 右パネル）。透明なポリマー窓をキューティクルに接着することにより、露出した胸腔を密閉します（図1e - 右パネル）。これらの窓の表面には固有の番号が刻まれており、これにより移植された動物を識別して区別することが可能になります。その後、胚盤を解剖段階に保持している UV 硬化性接着剤を除去することで動物を切り離し、動物が自由に行動できるようにします。

移植されたハエの繰り返しの穏やかなテザリングを容易にするために、二光子重合を使用して再取り付けステージ（図1fおよび補足図6）を印刷しました24。この製造プロセスは、動物を所定の位置に確実に保持する 3D フィーチャーを製造するために必要な精度を備えています。取り付け時には、マルチカメラアレイに囲まれた二光子顕微鏡システムを使用して動物を研究しました。このシステムにより、VNC23 の神経活動とマーカーレス 3D 身体部分追跡 25 の同時記録が可能になります (図 1g)。ほとんどの場合、私たちの移植プロトコルは成功しました。まれに、移植された動物は、イメージング中に VNC を閉塞する可能性のある呼吸器組織または消化器組織の特定の動きを示しました（補足図 7）。移植が成功すると、VNC への光学的アクセスが可能になり、1 か月間ほとんど変化がありませんでした。これにより、雌ハエ（補足ムービー 4）および雄ハエ（補足ムービー 5）の神経集団の構造（図 1h および補足ムービー 3）および機能動態の繰り返し研究が可能になりました。当社の長期記録ツールは、遺伝的に識別可能なニューロンのペアの記録にも適用できます。我々は、3 日間にわたる一対の DNA01 下行ニューロンの活動を画像化することによってこれを説明します (移植後 1、3、および 5 日 (dpi))。この活動は運動器の回転と相関しています 23 (補足図 8 および補足ムービー 6)。ここでは、VNCの頸部結合および前胸部（T1）ニューロメアへの光学的アクセスを獲得することに焦点を当てましたが（図1h）、私たちのアプローチは一般的であり、VNCの他の領域のイメージングを可能にするインプラントの再設計と微細加工を可能にします。概念実証として、インプラントを修正して、後胸部の組織を拘束し、T2およびT3ニューロメアへの光学的アクセスを可能にすることができました（補足図9）。

長期記録アプローチを検証するために、私たちはまず、インプラントが寿命に及ぼす潜在的な影響を研究しました。具体的には、3 つのグループの動物 (グループあたり n = 40) の寿命を測定しました: (i) 操作されなかったハエ (「無傷」)、(ii) 低温麻酔に耐え、解剖ステージに乗り、翼を持ったハエ除去（「偽移植」）、または（iii）完全な移植手順を受けたハエ（「移植」）。この実験では、移植された動物の 73% が手術後 4 時間以上生存しました。 1 匹のハエに対する外科手術と移植手順には開始から終了まで約 40 分かかるため、総スループット (この移植時間と急性生存率の組み合わせ) は 55 分あたり 1 匹の移植動物でした。移植後 4 時間以上生存したハエでは、最長 88 日の生存が観察されました。しかし、移植されたハエは、移植後の最初の数日間は無傷の動物よりも高い死亡率を示しました（図2a）。注目すべきことに、偽移植されたハエも同様に最初の数日で死亡率が増加しており、移植そのものではなく、移植前の動物の扱いが死亡率増加の原因であることを示唆している。 20日間にわたって調べた、移植された雄のハエと無傷の雄のハエで同様の生存率が得られました（補足図10a）。

a 遺伝的に同一の兄弟動物の生存曲線。(i) 実験的に操作されていない (緑色、「無傷」)、(ii) 繋がれ、低温麻酔をかけられ、羽が除去されている (青色、「偽移植」)、または (iii) ) 移植と胸部窓の追加 (オレンジ色、「移植済み」) によって長期画像化のために準備されています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。 b 丸い正方形のアリーナ内で光遺伝学的に活性化された後方歩行のダイナミクスを分析することによって、行動を比較しました。移動運動はコンピューターで分析され、プロットされ、動物の最初の前方軌道 (シアン色) とその後の光学的に誘発された後方歩行軌道 (紫色) が示されました。 c 30秒間の自発行動とそれに続く3秒間の光遺伝学的刺激期間中の無傷動物（上）、偽移植動物（中央）、移植動物（下）の並進速度（ピンク、「刺激」）。ここでは、1 か月にわたって 3 つの期間で記録されたデータをプールしました。生のトレース (灰色) と平均 (青) のトレースが表示されます。これらの時系列から、各刺激イベントは、(d)光遺伝学的刺激時の並進速度の初期の負の傾き---後方歩行---、(e)光遺伝学的刺激期間全体にわたって移動した後方歩行距離、および(f)光遺伝学的刺激期間全体にわたる負のピーク並進速度。 1 つのアスタリスク (*) は P < 0.05 を示します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

次に、移植は寿命に劇的な影響を与えなかったものの、胸腔内に微細加工された物体を配置すると、おそらく脚関連の筋肉組織の混乱または単に追加の負荷が原因で、歩行に悪影響を与える可能性があると推論しました。ハエはさまざまな歩行速度や操作でさまざまな歩行を行うため、この可能性を調査することは困難です26。したがって、歩行の定量的分析を実行できるようにするために、ムーンウォーカー下降ニューロン (MDN) で発現される光依存性カチオンチャネル CsChrimson27 の光遺伝学的活性化によって、定型的な後ろ向き歩行を駆動しました 28,29。私たちは、特注のアリーナ (図 2b) で動物を 1 か月間繰り返し刺激しました。これにより、無傷のハエ、偽移植されたハエ、または移植されたハエの歩行軌跡を定量化し、比較することができました。最初に自発的行動を30秒間記録し、次に590 nmのオレンジ色の光の3回の連続フラッシュをそれぞれ3秒間照射しました（図2c、ピンク色および補足図11a）。刺激間隔は10秒です。これらの実験は、1 か月にわたって 3 つの期間（移植後 1 ～ 3 日 (dpi)、14 ～ 16 dpi、および 28 ～ 30 dpi）で同じ動物に対して行われました。光遺伝学的刺激により、動物が後ろ向きに速い歩行を生成し、光が消えると徐々に速度が低下し、急速にベースラインに戻ることが観察されました（補足ムービー7）。すべての記録セッションを通じて、無傷群と偽移植群の間（P = 0.044 Kruskal-Wallis、事後コノバー検定）、および「無傷」群間で初期後方加速度（図2d）に小さな有意差が観察されました。および「移植」グループ（P = 0.044）。ただし、後方歩行の合計移動距離（図2e）および最大後方歩行速度（図2f）に関して、無傷動物、偽移植動物、および移植動物の並進速度には統計的な差は観察されませんでした。年齢制限されたコホートを比較した場合にも同様の結果が得られました。具体的には、どの年齢コホート（1～3 dpi、14～16 dpi、または28～30 dpi）でも、最初の後方加速度において、無傷群と移植群との間に差は観察されませんでした。無傷のハエは、後方への加速がわずかに遅くなりました（これは、Act88F:Rpr を発現している動物では垂れ下がっていた脚と翼の間の接触による可能性があります）。私たちは、（i）後方歩行応答の傾き（P = 0.009）、（ii）後方歩行距離（P = 0.0008）について、14〜16 dpiで両方の対照群間に有意な差があることに気づきました（補足図11b、c）。 )、および (iii) 負の最大並進速度 (P = 0.003)。自発歩行も、移植された雄のハエと無傷のハエでは質的に変化しませんでした（補足ムービー8）。総合すると、これらの結果は、移動が移植によって大きな影響を受けないことを示唆しています。

神経回路は成人期を通じて構造再構成の能力を保持します 30,31。これにより、神経系損傷32、33、34、および脳卒中35に応じた適応が可能になります。同様に、ハエでは、脚の切断後に運動歩行が再構築されます 36。しかし、切断が四肢制御回路に及ぼす影響は、これらの変化を明らかにするには数日または数週間にわたって切断された動物の VNC を画像化する必要があるため、依然として調査されていません。原理的には、脚切断後の特定の日に複数の動物のデータをプールすることもできますが、これには 2 つの大きな欠点があります。まず、動物間の変動により、特定の神経構造の変性を解決する能力が制限される可能性があります。第 2 に、このアプローチは時間がかかり、関心のある時点ごとにより多くの実験と動物が必要になります。対照的に、縦断イメージングは、比較的少数の動物を使用して神経構造の動的な変化を明らかにするのに理想的です。この可能性を説明するために、脚切断後の VNC における一次固有受容機械感覚求心性神経の劣化を追跡しました。具体的には、VNC の T1 ニューロメア内の切断された固有受容脚の大腿骨弦音器官 (Act88F-Rpr/+; iav-Gal4/UAS-GFP; +/+) の軸索末端を視覚化しました。ハエを羽化後（dpe）の初日に移植した。次に、移植後 1 日 (1 dpi)、T1 の体積測定二光子イメージングを実行しました。ボリュームは、1 μm の深さ間隔で撮影された 100 枚の画像で構成されています。次に、2 dpi で、各実験動物の左前脚を胸部 - 寛骨関節付近で切断しました (図 3a)。

a 実験動物では、左前脚が 2 dpi で胸部と寛部の関節で切断されました。 b フライ神経系の概略図。画像化された VNC 領域は強調表示されます (灰色)。 (c) 無傷のまま残された、または (d) 2 dpi で切断されたハエから記録された共焦点イメージングボリュームの標準偏差 z 投影 (nc82 染色ニューロピルは灰色で輪郭が示され、GFP 蛍光は黒色で示されます)。左前脚を切断した移植動物から組織を採取した。 VNC 組織を取り出し、20 dpi で染色しました。黒い矢印は、無傷の固有受容体神経支配と切断された固有受容体神経支配との間で最大の違いを示す VNC 領域を示します。スケールバーは50μmです。 (e) 無傷の動物 (対照)、または (f) 切断された動物から記録された Z スタックの最大強度投影。データは二光子顕微鏡を使用して取得されました。 1、2、4、および 15 dpi で撮影された画像が示されています。画像は1dpiの画像に登録されます。スケールバーは50μmです。白い矢印は、切断された動物の VNC の軸索末端の分解を示します。 g、h 無傷の動物（n = 5、青い三角）または切断された動物（n = 5、オレンジ-赤い丸）から二光子顕微鏡を使用して数日間にわたって測定された蛍光。測定値は、パネル e および f にあるように、(g) シアンまたは (h) 紫色の関心領域 (ROI) 内の平均蛍光を示し、正規化され、1 dpi での平均蛍光で除算されます。箱ひげ図は中央値、第 1 四分位数、および第 3 四分位数を示します。統計比較はマンホイットニー U 検定 (両側) で実行され、1 つのアスタリスク (*) は P < 0.05 を示し、2 つのアスタリスク (**) は P < 0.01 を示します。パネル g の場合、P = 0.006 (4 日目)。 0.006 (5日目); 0.009 (6日目); 0.006 (7日目); 0.018 (8日目); 0.009 (9日目); 0.006 (10日目); 0.006 (11日目); 0.009 (12日目); 0.006 (13日目); 0.006 (14日目); 0.006 (15 日目)。パネル h については、P = 0.03 (4 日目)。 0.006 (5日目); 0.009 (6日目); 0.006 (7日目); 0.009 (8日目); 0.009 (9日目); 0.006 (10日目); 0.006 (11日目); 0.009 (12日目); 0.006 (13日目); 0.006 (14日目); 0.006 (15 日目)。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

移植されたハエは脚の切断に耐え、残りの5本の脚で正常な行動をとりました（参考文献36と同様）。 15 日間毎日、対照動物 (「無傷」) および左前脚を切除した動物 (「切断」) から T1 画像ボリューム (図 3b) を収集しました。脚の切除から18日後にVNCの解剖、染色、および共焦点イメージングを実行し、VNCのT1ニューロメアの機械感覚神経支配が無傷の動物では持続している（図3c）が、切断された動物では分解している（図3d）ことを確認しました。二光子顕微鏡の画像ボリュームを詳しく調べると、対照動物では、数日間にわたってイメージング領域でいくらかの光退色が発生したことが明らかになりました（図3e）。ただし、この蛍光の低下は、切断された動物の左T1神経網の弦音器官軸索終末で観察されるシグナルの減少ほど深刻ではありませんでした（図3f、補足図12および補足動画9）。 VNC 37 内の弦音軸索神経支配の特定の関心領域 (ROI) 内の信号強度の変化を定量化することにより、切断動物と無傷動物における再現性の高い有意な蛍光減少を測定しました (マンホイットニー U 検定、* は P < 0.05 を示し、 ** は P < 0.01 を示します) (図 3g、h)。

神経回路は、数日から数週間にわたって形態学的に適応できることに加えて、動物の内部状態に応じて、より短いタイムスケールでそのダイナミクスを継続的に調整します。脊椎動物と同様に、ショウジョウバエでも、これらの状態には、空腹 38、疲労 39、性的興奮 40、攻撃性 41、および防御的興奮 42 が含まれます。内部状態は、カフェインなどの精神活性物質の摂取後に変化することもあります43、44、45。このような状態の変化中に回路がどのように再構成されるかを明らかにするには、神経系を継続的に監視することが重要です。

行動する動物の VNC 神経力学を研究するための私たちの以前の技術 23 では、腸の大部分を切除する必要があったため、動物の寿命が短くなり、内部状態の変化を捉える長期記録が不可能でした。さらに、味覚反応は脳で研究できるが46、腸を切除すると摂食ができなくなるため、満腹感や向精神性物質の摂取がVNCの神経力学をどのように調節するかを調査することはできない。当社の長期イメージングツールキットは腸を保存し、二光子顕微鏡検査中に動物に餌を与えることを可能にします。したがって、次に私たちは、薬物摂取が神経動態に及ぼす影響を明らかにするために、当社の技術をどの程度まで使用できるかを尋ねました。

低用量のカフェインに曝露されたハエは睡眠が減少し 43,44 、運動活動が増加しました 45。ここで私たちは、カフェイン摂取が神経集団動態の世界的な変化をどの程度促進する可能性があるかを尋ねました。これをテストするために、まず動物を 21 ～ 23 時間絶食させて摂食を促しました。次に、移植後、頸部結合部の神経活動を記録しました (「摂食前」)。神経活動の記録を続けながら、動物には8 mg / mlのスクロースと1 mgのアマランサス色素を含む対照溶液（「スクロースのみ」）（摂食を確認するため47）（補足ムービー10）のいずれかを与えました（図4a）。 8 mg/ml または 40 mg/ml のカフェインも含む実験溶液: それぞれ「低カフェイン」 (補足ムービー 11)、または「高カフェイン」 (補足ムービー 12)。次の 38 分間、神経活動と行動を記録し続けました。摂食は、色素摂取による腹部の色の事後評価によって確認されました（図4b）。画像化中に、脳とVNCを繋ぐ頸部結合を軸索が通過する上行性ニューロンと下行性ニューロンの活動を検査しました。これを行うために、神経系全体で遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターであるGCaMP6fと解剖学的マーカーであるtdTomatoを発現するハエの胸部頸部結合の冠状断面二光子イメージングを実行しました（図4c）23（ Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-opGCaMP6f; UAS-tdTomato/+)。動物の行動中に発生する画像の変形と平行移動を克服するために、オプティカルフローベースのアルゴリズムを使用して画像データを登録しました (方法を参照) 23。画像登録後、コロナル画像データから、行動を駆動する下行ニューロン 48,49 と進行中の行動状態を脳に伝える上行ニューロンに属する軸索の活動が明らかになります 50。これらの軸索は、二光子顕微鏡画像では楕円として見えます（図4d、白い矢印）。これらの汎ニューロン関心領域 (ROI) は、非常にまばらな下行 23 ニューロンと上行 50 ニューロンのセットにおける神経活動をイメージングしたときに観察されたものと一致しています。これは、頸部結合の背側正中線を通過する一対の大きな巨大繊維下行ニューロン軸索 51 で最も顕著です (図 4d、白い星印)。

a 2 光子顕微鏡を使用してニューロンを記録している間に餌を与えられているハエのデジタルレンダリング。 b 高濃度カフェイン溶液を摂取した後の二光子顕微鏡検査中の移植動物の写真。白い矢印は腹部の紫色を示し、アマランサス色素と混合したカフェイン-スクロース溶液の消化を確認します。 c 首の結合部の画像領域を示す腹側神経索の概略図。 d 首の結合部を通過する個々の軸索の注釈（矢印）を含む、摂食前のハエのすべての非運動期間中の色分けされた平均神経活動（fの上のパネルと同じデータ）。アスタリスクは巨大な線維軸索の位置を示します。 e 給餌前（青）、給餌中（緑）、給餌直後（オレンジ）、または給餌後長い間（赤）のいずれかの4分間の記録中に、胸部頸部結合を通過するすべての軸索にわたる正規化された蛍光。ハエには、スクロースのみ（左）、スクロースと低用量のカフェイン（中央）、または高用量のカフェイン（右）を含む溶液が与えられました。 f 高濃度カフェイン溶液の摂取前（上）、摂取直後（中）、または摂取後長期間（下）のハエのすべての非運動期間における色分けされた平均神経活動。 g 活動波の存在を示す統計分析。神経活動は、摂食前の活動から計算されたパラメーターを使用して正規化されます (方法)。最大の正規化された活動は、給餌前、給餌中、給餌後の条件ごとに 3 匹のハエについて示されています。最大活性は、高濃度カフェイン溶液を与えてから 29 分を超えてのみ有意に増加します（片側マンホイットニー U 検定、* は P < 0.05、両方とも P = 0.04 を示します * 報告されており、ns は有意でないことを示します）。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。 h 移植された 1 頭の動物の頸部結合は 4 つの関心領域 (ROI) に分割されます。これらは、標準偏差時間投影画像に重ねられます。 i 神経活動は、活動の波中のピーク蛍光に正規化されています。トレースはパネル h のように色分けされています。すべての領域にわたる平均蛍光のピークは 0 秒に集中します。 j アクティビティのピーク時のピクセル単位の時間。首の結合全体にわたる平均活動のピークは 0 秒として設定されます。

摂食前、摂食中、摂食直後の 3 つの実験条件すべてにわたって、歩行のエポックに関連する神経活動の変動が観察されました（図 4e、青、緑、オレンジのトレース、補足図 13c、フライ 7、補足図 13c）。映画10〜12）。しかし、給餌後29分以上経過すると、高濃度カフェイン溶液を給餌したハエに特有の活動の大きな波が観察されました（図4e、赤いトレース）。波の振幅は、自発的な運動に伴う神経活動の変動よりもはるかに大きかった。活動波は結合全体に広がり（図4f）、微小な動きを伴う全体的な硬い姿勢に関連付けられていました（補足ムービー13）。さまざまな時点および実験条件間での波の存在と振幅を定量化するために、各ハエの給餌前に観察されたものと比較して、頸部結合全体の神経活動を正規化しました。次に、給餌前、給餌中、給餌後の期間の最大正規化蛍光 (99% パーセンタイルの上限) を計算しました。給餌後〜29分まで、高濃度のカフェインを給餌したハエの最大活動レベルは、スクロースまたは低カフェイン溶液を給餌したハエと有意な差はありませんでした（マン・ホイットニーのU検定、P > 0.05）。対照的に、給餌後 29 分から 38 分の間では、高カフェイン溶液を給餌した各ハエの最大活動性は、神経活動の波により他の条件よりも有意に高かった (マン-ホイットニー U 検定、P = 0.040) (図.4g）。これらの波の時間的展開にも再現性があり、活動は背内側 (青) で始まり、次に背外側 (緑)、そして腹側 (オレンジ) の結合で始まりました。ジャイアントファイバーニューロン（赤）51は最後に活性化し、高い活性を長期間維持しました（図4h–jおよび補足図13d–i）。これらのデータは、当社の長期イメージングツールキットを使用して、食品や薬物の摂取が内部状態や全体的な神経動態にどのような影響を与えるかを調査できることを示しています。

ここでは、行動する動物の運動制御の包括的かつ長期的な研究を可能にするマイクロエンジニアリングデバイスについて説明しました。具体的には、VNC をターゲットにして VNC 内に存在する、運動前回路、感覚回路、および運動回路を含む、成体キイロショウジョウバエの胸部組織の長期二光子記録を可能にします。私たちのツールキットは、脳内のニューロンの縦方向の記録を可能にする単純なアプローチとは対照的に、VNC の長期記録という特有の課題に対処するように設計されています 12,13。これは、(i) マイクロマニピュレーターアーム、(ii) ポリマー、胸部臓器を移動させるためのベースのソフトインプラント、(iii) 胸部開口部を密閉するために再現可能な方法で製造できる番号付きの透明なポリマー窓、および (iv) 動物の胸部の周りに優しく繰り返し取り付けることを可能にする準拠したテザリングステージ二光子イメージング用。これらのツールを組み合わせることで、移植された動物の寿命を著しく短縮したり、運動行動を著しく混乱させたりすることなく、神経記録の時間枠がわずか数時間 23 から 1 か月以上に拡張されます。我々は、(i) 神経形態、汎ニューロン活動、およびまばらな神経活動の数週間にわたる記録、(ii) VNC への四肢感覚ニューロンの投射の数週間にわたる分解など、長期イメージングアプローチのいくつかのユースケースを示しました。 (iii) 薬物摂取後の神経活動の全体的な変化。

私たちの寿命実験では、移植されたハエの寿命が無傷の動物の寿命と同様であることが確認されました。しかしながら、手術後の最初の数日以内の超過死亡により、移植されたハエと擬似移植されたハエでは生存曲線が変化した。これは、これらの初期損失は外科的処置によるものであり、移植に特に関連しているわけではないことを示唆しています。これと一致して、我々の後ろ向き歩行の研究では、対照動物と移植動物との間で運動指標に明らかな変化がないことが明らかになった。しかし、将来的には、求愛やギャップ横断などのより複雑な行動に対する移植の影響が最小限であることを確認することが重要になるでしょう。

私たちのツールキットの最初のケーススタディでは、脚切断後の 2 週間にわたる VNC への弦音投影の解剖学的劣化を調査しました。そこで我々は、切断後の最初の週に機械感覚ニューロン終末の顕著な劣化を観察した。この分解の時間変化は ROI 全体で不均一であり、分解に対する堅牢性のレベルが異なる可能性がある別個の弦音細胞集団の存在と一致しています 37。あるいは、一部の末端は T2 (中脚) または T3 (後脚) からの上行突起を介して生じ、したがって前脚切断の影響を直接受けない可能性があります。ショウジョウバエは神経損傷のモデルとしてこれまでに多くの研究で使用されており 52、損傷後の軸索分解は哺乳類のワラー変性と類似している可能性があることが示されています 53。したがって、私たちの長期イメージングツールキットは、将来的には、運動回路における損傷によって誘発される軸索変性を遅らせたり、予防したりできる薬理学的介入をテストするために使用される可能性があります。

カフェイン摂取後の胸部頚部結合部の下行性ニューロンと上行性ニューロンの活動を分析したところ、以前に報告された行動の変化にもかかわらず、低濃度のカフェイン条件では神経活動の大きな変化は観察されませんでした45。一方で、高濃度のカフェイン溶液を摂取した後の神経活動の大きな波が観察されました。一部のハエにはこれらの波がいくつかあり、これは最終細胞死プロセスからのカルシウム放出によるものではないことを示唆しています。しかし、これらのカルシウム動態の起源は依然として不明です。例えば、カフェインは、内部に貯蔵された Ca2+54 の細胞質放出を誘導することが示されています。カフェイン摂取の場合にはこれは考えにくいかもしれないが、時間的に伝播する活動波がそのようなメカニズムによるものなのか、それとも深部の神経発火によるものなのかは依然として不明であり、これらのツールを使用した将来の研究の焦点となる可能性がある。特に、動物が高濃度カフェイン溶液を摂取した後も回復しないことが観察されました。それにもかかわらず、この概念実証は、行動する動物の神経力学に対する薬物摂取の影響をスクリーニングするために、ショウジョウバエの長期イメージングが将来どのように使用される可能性があるかを示しています。

これらの成功したケーススタディに基づいて、当社のマイクロエンジニアリングされた長期画像デバイスを活用して、さまざまな追加の疑問や課題を研究できると考えています。たとえば、これらのデバイスを適用して、パーキンソン病などの神経疾患のショウジョウバエモデルにおける細胞死の進行を記録することが考えられます55。当社のインプラント製造パイプラインも汎用化可能です。したがって、インプラントの形状は、メスの交尾受容性を調節する腹部神経節回路の標的化など、他の実験的課題に対処するために適応させることができる可能性がある56。さらに、インプラントは、例えば制御された方法で化合物を血リンパに送達する活性成分を貯蔵および放出するように改変される可能性がある。最後に、たとえば、UV エキシマレーザーを使用して胸部のキューティクルを開く 57 か、胸部臓器を自動的に移動させ、インプラントを配置し、胸部の穴を窓で密閉するロボット操作技術を開発するなど、移植を自動化するための追加の手順が講じられる可能性があります 58。

要約すると、この研究で提示された技術開発により、さまざまな時間スケールにわたる個々のハエでのさまざまな実験が可能になり、生物学的システム、特に前運動回路と運動回路が老化や病気の進行中にどのように変化するかについての理解が開かれます。内部状態の変化に反応した、または食物や薬物摂取の結果としての、怪我、学習、または社会的経験。これらのデータは、継続的に変化する機能やニーズに対応するために形状や機能を変化させる能力を備えた人工システム用の、より適応性の高いコントローラーの開発を刺激することができます。

胸部窓（透明なポリマーディスク）はフォトリソグラフィーを使用して作製されました59。すべての露光ステップは、i ライン照明を使用してマスクアライナー (MJB4、Süss MicroTec、ドイツ) 上で実行されました。クロムマスクは、ダイレクトレーザーライター（VPG-200、Heidelberg Instruments、ドイツ）および自動マスクプロセッサ（HMR900、HamaTech、ドイツ）を使用して製造されました。微細加工構造の寸法は、光学顕微鏡 (DM8000 M、Leica Microsystems、スイス) または機械表面プロファイラー (Dektak XT、Bruker Corporation、米国) を使用して測定されました。このプロトコルは、4 インチのシリコンウェーハの表面をプラズマストリッパー (PVA TePla 300、PVA AG、ドイツ) で 500 W で 7 分間処理して、その濡れ性を低下させることから始まりました。 20% (wt/vol) デキストラン (MP Biomedicals、分子量 60k ～ 90kg/mol) の水溶液を 1000 rpm で回転させ (WS-650-23、Laurell Technologies Corporation、米国)、150 °C で 1 分間ベークしました。 2 分間かけて厚さ 1 μm の水溶性犠牲層を形成します。この層により、製造プロセスの最後に窓を静かに取り外すことができます（補足図1a〜i）。ネガ型フォトレジスト（SU-8 3025、Kahaku Advanced Materials、米国）を犠牲層上に直接スピンコートし、ソフトベークしました（補足図1a-ii）。特に、この厚さでは、SU-8 の透過率は 95% を超えています60 (https://kaakuam.com/wp-content/uploads/2020/07/KAM-SU-8-3000-Datasheet-7.10-final) .pdf)。露光後、ウィンドウをポストベークし、未硬化のレジストを現像液（プロピレングリコールメチルエーテルアセテート（PGMEA、1-メトキシ-2-プロパノールアセテート）、Sigma-Aldrich、ドイツ）で除去しました（補足図1a-iii）。。次に、自動処理システム (ACS200 Gen3、Süss MicroTec、ドイツ) を使用して、SU-8 ウィンドウを備えたウェーハを厚さ 20 μm のポジ型フォトレジスト層 (AZ 40XT) でコーティングしました。この追加のポリマー層は、金属蒸着プロセス中に物理マスクとして機能します。 2 番目のクロムマスクは、フォトリソグラフィーを使用してウィンドウ上に固有の識別子をパターン化するために製造されました。次に、物理蒸着（EVA 760、Alliance-Concept、フランス）を使用して、ウェーハをそれぞれ 3 nm と 15 nm の厚さで Ti および Au フィルム 61 でコーティングしました（補足図 1a-iv）。ネガ型フォトレジスト (Remover 1165、Kahaku Adv. Mat.、米国) の現像により、マーカーとして機能する数字を除いて、ウィンドウ上部のすべての層が除去されました。最後に、犠牲層を脱イオン水に溶解することによって、ラベル付きウィンドウを解放しました（補足図1a〜vi）。実験で使用する前に、窓を濾過し、室温で乾燥させ、滅菌した。得られた窓は光学的に透明であり（補足図1b）、胸部開口部を密閉するのに適切なサイズでした（補足図1c）。

私たちは、スループットを最大化し、マスターモールドを過度の使用から保護し、技術の普及を促進するために、2 レベルの微細加工技術を開発しました62,63。簡単に言うと、インプラントは、マスターモールドとして機能するエッチングされたウェーハから製造されたエラストマーテンプレート内に鋳造されました。まず、4 インチのシリコンテストウェーハ (100/P/SS/01-100、Siegert Wafer、ドイツ) をヘキサメチルジシラザン (HMDS) (CAS 番号: 999-97-3、Sigma-Aldrich、ドイツ) で処理し、脱水しました。 125 °C で表面への接着を強化します。次に、自動レジスト処理システム（EVG 150、EV Group、ドイツ）を使用して、ウェーハに厚さ8μmのポジティブフォトレジスト膜（AZ 9260、Microchemicals GmbH、ドイツ）をスピンコートしました（補足図3a〜i）。ベーキング、露光、現像ステップの後、ウェーハはディープ反応性イオンエッチング（DRIE）、具体的にはボッシュプロセス64（AMS 200 SE、Alcatel）を使用して処理され、高アスペクト比のほぼ垂直な壁が得られました（補足図1）。 3a-ii)。残ったポジ型レジストは、70℃のリムーバー（リムーバー1165、カヤクアドバンストマテリアルズ、米国）で剥離され、水ですすぎ、風乾することによって洗浄されました（補足図3a〜iii）。エラストマーテンプレートは、ポリジメチルシロキサン (PDMS) を使用したレプリカ成形によって製造されました。レプリカ成形プロセスは、真空チャンバー内でマスターモールドの表面にシラン (トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル) シラン、Sigma-Aldrich、ドイツ) を 6 時間蒸着することから始まりました。シラン化は永久的なシラン層を形成するため、一度だけ実行されます。 PDMS はエラストマーと硬化剤 (GMID 番号: 01673921、Dow Europe GmbH、ドイツ) の混合物 (10:1、wt/wt) として調製され、ペトリ皿内のウェーハ上に注がれました。高アスペクト比のウェル内に閉じ込められた気泡を解放するために、真空デシケーター (F42020-0000、SP Bel-Art Labware & Apparatus) 内の真空ポンプ (EV-A01-7、Swiss Vacuum Technologies SA、スイス) を使用して金型を脱気しました。、米国）。最後に、エラストマーをオーブン（UF30、Memmert GmbH、ドイツ）内で65℃で5時間硬化させ、PDMSスラブを剥がしました（補足図3b）。次に、アライメントマーカーをガイドとして使用して、スラブをかみそりの刃でいくつかの部分に切断し、インプラントを作製するためのテンプレートとして機能させました（補足図3c）。

柔軟なインプラントは、光硬化性ポリマー (Ostemer 220、Mercene Labs AB、スウェーデン) から製造されました。重合は、2 つの成分 (パート A とパート B) の混合物が UV 光にさらされると発生します (補足図 4a-i)。 PDMSテンプレートを真空デシケーター内で1時間シラン化しました(トリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン、Sigma-Aldrich、ドイツ)。(補足図4a-ii)。パート A を 48 °C で一晩加熱して、溶液中に未溶解の結晶が残っていないことを確認しました。パート B と容器も混合前に 48 °C まで加熱しました。次に、パート A とパート B を完全に混合し、混合物を真空チャンバー内で 5 分間脱気しました。 200μLの混合物（1.86：1、wt\wt）をテンプレート上に注ぎ（補足図4a〜iv）、2つのクリップを使用してテンプレートを2枚のガラススライドの間に機械的に挟みました。インプラントポリマーに接触するスライドガラスは、ガラスとインプラントの間の接着を改善することによってインプラントの解放を促進するために、事前に29Wで1分間プラズマ処理されました（PDC-32G、Harrick Plasma、USA）。溶液をUV光（365 nm、UV9W-21、Lightning Enterprises、米国）に10分間曝露して重合させました（補足図4a〜v）。テンプレート全体で均一な反応を確実にするために、UV 露光中にサンプルを数回回転させました。インプラントは、ソニケーター（DT 100 H、Bandelin Sonorex Digitec、ドイツ）を使用してイソプロピルアルコール（IPA）中でテンプレートを機械的に撹拌することによって放出されました（補足図4a〜vi）。このプロセス全体により、100個のインプラントを含むウェーハが得られ（補足図4b、c）、その後、注入前にカミソリの刃を使用して切り取られました。

移植中に胸部臓器を一時的に移動させるマニピュレーターアームを設計および構築しました（補足図5a、b）。アームを構築するために、まず、解剖ピン (26002-10、Fine Science Tools、ドイツ) を注射針 (15391557、Fisher Scientific、米国) の先端に再現可能な方法で接着できる金型を 3D プリントしました (補足図5c)。ピンは、その先端が金型の端に接触するまで針に挿入されます。ＵＶ硬化性接着剤（カナダ、オンタリオ州オーロラのＢｏｎｄｉｃ）を使用して、ピンを針に接着した。次に、鉗子を使用してアームを曲げ、2 番目の 3D プリント金型によってガイドしました (補足図 5d)。ピンは最初に粗く曲げられ、次に 3D プリントされた金型を使用してより細かく調整されました。次に、別の 3D プリント片を使用して、注射針を 3 軸マイクロマニピュレーター (DT12XYZ、ThorLabs、米国) と延長ステージに接続しました (補足図 5a)。次に、構造全体をブレッドボード（MB1224、ThorLabs、米国）に取り付けました（補足図5b）。

我々は、直接レーザー書き込み65を使用して、2光子顕微鏡検査中にハエを所定の位置に保持するカスタム準拠の機構を作製しました。この機構は 3D CAD ソフトウェア (SolidWorks 2021、Dassault Systémes、フランス) を使用して設計されました。 25 mm × 25 mm のダイシングされたシリコンウェーハを基板として使用し、その上に構造をプリントしました。基板の表面を 500 W で 7 分間プラズマ処理し、スピンを使用して 10% (wt/vol) ポリ(アクリル酸) (MW 50000、Polysciences、USA) の水溶液を 2000 rpm で 15 秒間コーティングしました。 -コーター（WS-650-23、Laurell Technologies Corporation、米国）（補足図6a-i-iii）。この機構は、二光子重合を制御するダイレクトレーザーライター（Photonic Professional GT+、Nanoscribe GmbH、ドイツ）を使用して製造されました（補足図6a〜iv）。ポリマー (IP-S、Nanoscribe GmbH、ドイツ) は、ヤング率 4.6 GPa66 と構造を印刷できる解像度のため、印刷材料として選択されました。 25 倍の対物レンズ (NA 0.8、Zeiss) によって提供される最大レーザースキャン領域は 400 μm であるため、全体の設計は複数のフレームに分割されました。このアプローチにより、比較的大きなレイアウト上で精細な印刷が可能になります。印刷中に対物レンズを液体フォトレジストに浸しました。印刷プロセスの最後に、現像液（PGMEA、Sigma-Aldrich、ドイツ）を20分間使用して未硬化ポリマーを除去しました（補足図6a〜v）。最後に、IPA を使用して PGMEA をリンスしました。この機構は、犠牲層を脱イオン水に溶解することによって基板から解放されました（補足図6a〜vi）。これにより、ハエの胸部を含むのに十分な大きさの微細加工構造が得られました（補足図6b、c）。再取り付けステージは、UV 硬化性接着剤 (カナダ、オンタリオ州オーロラ、Bondic) を使用してレーザーカットされたアルミニウムフレームに機構を取り付けることで完了しました。

当社の微細加工デバイスの製造に必要な材料と装置は、補足表 2 および 3 にまとめられています。

長期 VNC イメージング用にハエを準備するために必要な手順をここで説明します (図 1e、内臓は参考文献 67 のデータを使用してスケッチされています)。詳細については補足ムービー 2 を参照してください。

ハエに５分間冷麻酔をかけた。次に、それを解剖ステージの下側に配置し、鉗子を使用して翼の基部近くを除去しました。次に胸部をステージのスチールシム (McMaster-Carr、米国、0.001 インチのステンレス鋼、タイプ 316 軟焼きなまし; 部品番号 2317K11) の穴 (Etchit、ミネソタ州バッファロー) を通して押し込みました。その後、ステージを上下逆さまにしました。そして、ＵＶ硬化性接着剤（カナダ、オンタリオ州オーロラ、ボンディック）をほんの一滴垂らして、ハエを所定の位置に固定した。

ステージには生理食塩水が満たされていました (補足表 1)。次いで、３０Ｇの注射針を使用して、背側胸部表皮に小さな長方形の穴（直径６００μｍの窓よりも小さい）を切った。穴は、胚盤に近い後胸部に針を挿入することによって開けられました。次に、胸部の側部と前部に 3 本の線を切り込みました。最後の線をカットして長方形の開口部を完成させました。次いで、得られたキューティクル片を鉗子を使用して除去した。

残存する劣化したＩＦＭを、鉗子を使用して開いた胸部から除去した。次に、引き抜いた（P-1000、Sutter Instrument、USA）ガラス針（30-0018、Harvard Apparatus、USA）を使用して、気管の大きな部分と腸の左側との間の小さな気管リンクを切り離しました。次いで、左の唾液腺も鉗子を使用して除去した。

マニピュレーターアームは、先端が見える状態でステージ上に配置されました。解剖ステージは、ハエの頭が実験者の方を向くように配置されました。次に、3 軸マニピュレーター (DT12XYZ、ThorLabs、米国) を使用してアーム先端を胸部に挿入しました。次いで、アームの先端を、前胃の中央付近にある（実験者の）腸の右側に挿入した。チップは、作物および唾液腺の下にあるが、VNC には触れない程度に十分深く挿入されました。アームの先端が唾液腺、溝、腸の右側に来ると、胸腔の左側に向かって引っ張られ、閉じたインプラントのためのスペースが作られました。

ハエの臓器が操作アームによって胸腔の左側にしっかりと保持されたら、鉗子を使用してインプラントを空中で閉じ、解剖ステージを満たす生理食塩水中に移しました。次に、閉じたインプラントをステージ上のハエの前に配置しました。次に、より薄い鉗子を使用してインプラントを動物の胸部に挿入しました。最後に、ガラス針を使用してインプラントの位置を調整し、インプラントを適切な高さに保ち、受動的に開くことができるようにしました。開いたら、ガラス針を使用して、アームを取り外している間、インプラントの左側を胸部の底に向かって軽く押し、インプラント上の気泡を取り除きました。

インプラントが適切に配置されたら、注射針 (15391557、Fisher Scientific、米国) を使用してステージから生理食塩水を除去しました。次いで、窓をクチクラの穴の上に配置し、胸部後部の胚盤近くの識別番号の中心に配置した。次に、ワイヤーを使用して、窓と周囲の胸部キューティクルの間に、胚盤の右側から始めて左側で終わる、UV 硬化性接着剤の小さな滴を追加しました。次いで、生理食塩水をステージに戻しました。以前にハエをステージに繋いでいた硬化した UV 接着剤を針を使用して取り除きました。次に、生理食塩水も除去し、ハエの胚盤近くの後部表皮に UV 接着剤を塗布して硬化させ、窓を完全に密閉しました。

胸部の穴が透明な窓で完全に密閉されたら、鋼製シムの穴を通して胸部の前面を静かに押すことによって、ハエを解剖ステージから降ろした。その後、ハエを餌の入ったバイアルに戻して回復させた。

すべてのハエは標準的なコーンミール餌で 12 時間明期:12 時間暗期のサイクルで飼育されました。特定の各研究の実験は、概日関連の交絡因子の可能性を排除するために、一日の一貫した時間に実行されました。ショウジョウバエの実験には特別な倫理的承認は必要ありませんでした。ほとんどの実験では、メスのハエの方がサイズが大きいため、メスのハエが使用されました。これにより、切開、移植、およびテザリングが容易になります。また、計算による画像処理や神経関心領域の検出も容易になります。

Moonwalker 下降ニューロン (MDN)28 (UAS-CsChrimson/Act88F-Rpr; VT50660.p65AD(attp40)/+; VT44845.Gal4DBD(attp2)/+) で CsChrimson を発現するメスのハエ (図 2) を 5 日目に移植しました。羽化後（dpe）。この実験では、移植前に、機械的に閉じた状態でインプラントを 30 mg/ml デキストラン溶液 (#31392、Sigma-Aldrich、スイス) に浸漬しました。次に、インプラントを溶液から取り出し、ツイストキムワイプ (5511、Kimberly-Clark、USA) を使用して乾燥させました。このステップは、インプラントを閉じた位置に固定するために実行されました。しかし、後にインプラントを閉じるのにデキストランは必要ないことがわかり、このステップを削除しました。次いで、インプラントを上記のようにハエの胸部に配置した。移植後の日数は、「移植後の日数」(dpi)として示されます。年齢と性別を一致させた対照動物を、同じ親交雑から選択した。寿命の研究では、ハエを個別に餌バイアルに入れて 1 ～ 2 日ごとに評価しました。

移動の研究は 1 ～ 3 dpi、14 ～ 16 dpi、および 28 ～ 30 dpi で実行されました。動物は個別に冷麻酔され、光遺伝学的活性化とビデオ録画のために丸い正方形のアリーナに移されました。各記録は、30 秒間の自発的行動 (主に歩行と毛づくろい) と、それに続く 590 nm (6 mW/cm2) での 3 秒間の光遺伝学的刺激 (刺激間隔 10 秒) から構成されていました。したがって、各録音セッションの長さは 59 秒でした。

ビデオデータを処理するために、Tracktor68 のカスタマイズされたバージョンを使用してハエの重心が追跡されました。次に、手動でラベル付けされたデータでトレーニングされたニューラルネットワーク (PyTorch69 で実装) を使用して、それらの方向が抽出されました。ネットワークは 2 つの畳み込み層と、その後に続く 3 つの完全に接続された層で構成されています。最後の層を除くすべての層の後に、ReLU 活性化関数が続きました70。また、最初の 2 つの完全に接続された層の後にドロップアウトを 0.2 の確率で適用しました71。ネットワークをトレーニングするために、3 つの方向 (頭上、頭下、横) で合計 300 個のサンプルに手作業でアノテーションを付けました。次に、Tracktor の重心位置を使用してグレースケール画像が切り取られ、32 × 32 ピクセルにサイズ変更されました。トレーニング中に、アフィン変換 (回転 20 度、平行移動 5 ピクセル、およびスケーリング係数 0.2)、水平方向および垂直方向の反転拡張を 0.5 の確率でランダムに適用しました。すべてのデータ拡張には PyTorch の torchvision パッケージを使用しました。ネットワークは、データの 80% を使用してクロスエントロピー損失を考慮してトレーニングされました。学習率 0.001 の Adam オプティマイザーを使用し、重みの減衰や学習率の低下はありませんでした 72。 1000 エポックでトレーニングし、テスト誤差が最も優れた重みを選択しました。

並進速度は、重心位置に 1 次導関数を備えた 2 次 Savitzky-Golay フィルターを適用することによって計算されました。速度値の符号は、動物の進行方向に逆らった動きについては負に設定されました。刺激期間中にアリーナの壁に 0.3 秒以上衝突したハエは分析から除外されました。刺激期間中に背をひっくり返した（すなわち、シグマコーティングされた天井の上を歩いた）ハエも分析から除外した。「後方歩行反応勾配」メトリクスは、各刺激期間の開始からその期間に到達した最小速度（最大後方速度）までの加速度として計算されました。「後方歩行距離」メトリクスは、各刺激期間中の速度曲線の左リーマン和として計算されました。速度が負のフレームのみを考慮しました。最後に、「負の最大並進速度」は、各刺激期間で到達する最小速度値です。

雄の生存と行動を研究するために、間接飛翔筋に Reaper を発現している動物 (Act88F-Rpr; UAS-GFP; +/+) を羽化後 1 日 (dpe) で移植しました。年齢と性別を一致させた対照（「無傷」）動物を、同じ親交雑から選択した。ハエは個別に食品バイアルに収容され、寿命を評価しながら毎日新しい食品バイアルに入れ替えられました（補足図10）。自発的行動は、1 グループあたり 3 匹の雄について記録されました。これらの男性は個別に冷麻酔をかけられ、ビデオ録画のために丸い四角いアリーナに移されました。各記録は、60 秒間の自発的に生成された行動で構成されます。

神経系全体で GFP を発現する雌のハエ（Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GFP; +/+）（図 1h）を 4〜6 dpe で移植し、個別に食餌バイアルに保管しました。 1 ～ 3 dpi、14 ～ 16 dpi、および 28 ～ 30 dpi で、ハエを再取り付けステージに繋ぎ止め、二光子顕微鏡 (ベルガモ II 顕微鏡、 ThorLabs、米国）およびサンプル位置で 20 mW の出力の 930 nm レーザー（MaiTai DeepSee、Newport Spectra-Physics、米国）を使用します。ガルバノ共鳴スキャナーを使用して、0.1 ボリューム/秒 (vps) を取得しました23。次に、Fiji73 の HyperStackReg モジュールと剛体変換を使用して、深度ごとに 25 枚の画像を相互に登録しました。次に、これらの登録された画像を時間軸に沿って 1 つの標準偏差画像に投影します。結果として得られたボリュームは、フィジーの Temporal-Color マクロを使用して深度色コード化されました。

雄のハエでの実験のために、神経系全体でGFPを発現している動物を画像化しました（Act88F-Rpr; GMR57C10-Gal4 / UAS-GFP; +/+）（補足図10）。これらの動物に 1 dpe で移植し、個別に食餌バイアルに入れて保管しました。 1 dpi、5 dpi、および 10 dpi でハエを繋留し、2 光子顕微鏡を使用して 930 nm、11 mW のレーザー出力で VNC の体積記録を実行しました。イメージングボリュームを記録しながら、腹部に適用される二酸化炭素（1.3リットル/分）を使用してハエを麻酔しました。ボリュームは、合計深さ 100 μm にわたって 1 μm ごとに取得された 512 × 512 ピクセルフレームで構成されています。次に、フィジーの「Temporal-Color」マクロを使用した深度カラーコーディングで Z 投影が生成されました。

神経系全体で GCaMP6f および tdTomato を発現するハエ (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) を 5 dpe (雌) または 1 dpe (雄) で移植し、次に、 1、5、10 dpi の 2 光子イメージングステージ (女性、補足ムービー 4、男性、補足ムービー 5)。前胸部ニューロメアの 1 つの水平イメージング平面は、2 光子顕微鏡を 930 nm、出力 25 mW で使用して取得されました。ガルボ共鳴スキャナを使用して 3 つの水平 Z 面画像が取得され、10.7 fps のイメージングレートで 1 つのフレームに平均化されました。動作フレームは 80 fps の速度で同時に取得されました (参考文献 23 と同様)。

DNA01 下行ニューロンで GCaMP6f と tdTomato を発現する雌のハエ 23,48 (Act88F-Rpr/+; GMR22C05-AD-spGal4/UAS-GCaMP6f; GMR56G08-DBD-spGal4 / UAS-tdTomato) を 3 dpe で移植しました。次に、同じハエを 1、3、5 dpi で 2 光子顕微鏡ステージに取り付けました。前胸部ニューロメアの 1 つの水平イメージング平面は、2 光子顕微鏡を使用して 930 nm、28 mW のレーザー出力で取得されました。水平面画像は、Galvo-Galvo スキャナーを使用して 5.6 fps の撮像速度で取得されました。動作フレームは 80 fps の速度で同時に取得されました (参考文献 23 と同様)。 AxoID は、2 光子顕微鏡画像内の関心領域 (ROI) としてニューロンを検出し、その蛍光値を抽出するために使用されました50。参考文献に記載されている半自動神経蛍光イベント分類器。 50 は、蛍光トレースから神経活動イベントを検出するために使用されました。次に、これらを球状のトレッドミルの回転と相関させました。

他のインプラント設計を使用して、神経系全体で GFP を発現するメスのハエ (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) を 3 dpe で解剖しました。ＵＶ接着剤の一滴をインプラントの先端上で硬化させた。インプラントもわずかに変更され、ハエの胸部に挿入されると、硬化した接着剤が胚盤の内部キューティクルに当たるようにインプラントを後方に押し込み、インプラントを所定の位置に固定しました。次いで、透明な窓を使用してハエを閉じた。 VNC のイメージングボリューム (576 × 576 ピクセル、深さ 100 μm) は、ガルボ-ガルボスキャナーを備えた二光子顕微鏡を使用して、930 nm、レーザー出力 22 mW で記録されました。

弦音器官で GFP を発現するメスのハエ (Act88F-Rpr/+; iav-Gal4/UAS-GFP; +/+) (図 3) を 1 dpe で移植しました。 VNC の Z スタックは、55 mW のレーザー出力で 930 nm の二光子顕微鏡を使用して 1 dpi で記録されました。 Zスタックを記録しながら、腹部から供給される二酸化炭素(1.8リットル/分)でハエを麻酔した。 Z スタックは、合計深さ 100 μm にわたって 1 μm ごとに取得された 576 × 384 ピクセルフレームで構成されていました (つまり、ボリュームあたり 100 フレーム)。次いで、解剖鋏（＃１５３００－００、ファインサイエンスツールズ、ドイツ）を使用して、左前脚を胸部－寛骨関節で切除した。 2 番目の Z スタックがすぐに記録されました。ハエを個別に餌バイアルに入れ、同じ記録パラメータを使用して 15 dpi まで毎日画像化しました。次に、SIFT 登録プラグイン 74 を使用したフィジーの線形スタックアラインメントを使用して、投影されたすべての Z スタックを最初の Z スタックに登録しました。次に、カスタム Python スクリプトを使用して、特定の関心領域の平均蛍光を描画および抽出しました。これらの領域内の平均蛍光を毎日測定し、初日の平均蛍光で割ることにより動物間で正規化した。

ハエの神経系を解剖し、パラホルムアルデヒド (441244、Sigma-Aldrich、USA) で 20 dpi で固定しました。サンプルは、PBST 溶液で 1:20 に希釈したマウス抗 nc82 一次抗体で nc82 に対して染色し、続いて 1:500 に希釈したヤギ抗マウス Alexa 633 結合二次抗体で染色しました (詳細な手順は参考文献 23 に記載)。これにより、神経網ランドマークと内因性 GFP 発現の両方を含む共焦点画像を取得することができました。 Zen 2011 14.0 ソフトウェアを使用して共焦点画像を取得しました。共焦点レーザー強度と PMT ゲインは、ピクセルの飽和を避けるために手動で選択されました。これらの共焦点 Z スタックは、フィジーの標準偏差投影法を使用して 2D に投影されました。 GFP 発現の標準偏差投影を反転画像として示します (図 3c、d)。 nc82 画像の標準偏差投影を使用して VNC の境界を検出するカスタム Python スクリプトが作成されました。この輪郭は、Open CV ライブラリを使用して検出され、GFP 標準偏差投影画像上に描画されました。

神経系全体でカルシウムインジケーター GCaMP6f および解剖学的マーカー tdTomato を発現するメスのハエ (5 dpe) (Act88F-Rpr/+; GMR57C10-Gal4/UAS-GCaMP6f; UAS-tdTomato/+) (図 4)湿ったキムワイプ（5511、キンバリークラーク、米国）の上で21〜23時間飢餓状態にさせた。次に、それらは胸部窓なしで移植され、介入の回数を制限するために解剖ステージ上に維持されました（ここでは再マウントステージは使用されませんでした）。次に、動物を二光子顕微鏡の下に配置し、直径 1 の空気支持 (0.8 L/min) フォームボール (Last-A-Foam FR7106、General Plastics、米国) で構成される球形のトレッドミル上を歩くことができました。センチ23。次に、頸部結合部の冠状断面を、15 mW のレーザー出力を使用して 930 nm で画像化しました。ガルバノ共鳴スキャナーを使用することで、16 フレーム/秒 (fps) のイメージングレートを達成しました。並行して、ハエの行動が 7 台のカメラを使用して 80 fps で記録されました。ボールの回転も、2 つのオプティカルフローセンサーを使用して 3 つの軸に沿って測定されました 6,23。それぞれ約 4 分間のトライアルで神経活動と行動を記録しました。まず、4 つのトライアルを記録しました。次に、泡球を下げ、ハエに (i) 1 ml の脱イオン水、8 mg のスクロース (A2188.1000、Axon Lab、スイス)、および 1 mg のアマランサス色素 (A1016、 Sigma-Aldrich、米国）、（ii）1 ml の脱イオン水、8 mg のカフェイン（C0750、Sigma-Aldrich、米国）、8 mg のスクロースおよび 1 mg のアマランサスからなる低濃度カフェイン溶液、または（iii）高濃度カフェイン溶液1 ml の脱イオン水、40 mg のカフェイン、8 mg のスクロース、および 1 mg のアマランサスからなる濃度の過飽和カフェイン溶液。動物には、引き抜きガラス針 (P-1000、Sutter Instrument、USA; 引き抜きパラメーター - 熱: 502; 引き: 30; 速度: 120; 時間: 200; 圧力: 200) を使用して餌を与えました。溶液が針の上を移動するのを防ぐために、ＵＶ硬化性接着剤（カナダ、オンタリオ州オーロラ、ボンディック）をほんの一滴針の先端近くに加えた。マニピュレーター (uMp-3、Sensapex、フィンランド) を使用して針をハエの前に配置しました。餌を与えた後、球形トレッドミルをハエの下に再配置し、さらに 8 回の画像トライアルを取得しました。

特に明記されていない限り、カスタム Python コードを使用しました。すべての画像解析において、Y 軸はハエの体に沿った腹側 - 背側、X 軸は内側 - 外側です。画像およびフィルターのカーネルサイズは、ピクセル単位の (y, x) として指定されます。胸部頸部結合からの記録は、大きな平行移動を含む大きなフレーム間の動きや、小さな非アフィン変形の影響を受けます。カルシウムインジケーター (GCaMP6f など) はベースライン蛍光が低くなるように設計されているため、運動補正に使用するのは困難です。したがって、共発現された赤色蛍光タンパク質 tdTomato からのシグナルを利用して、赤色 (tdTomato) と緑色 (GCaMP6f) の両方の PMT チャネル画像を登録しました。まず、記録された各フレームの質量中心 (COM) レジストレーションを実行して大きな移動を削除し、首の結合部の周りの背景領域をトリミングしました (480 × 736 から 352 × 576)。次に、オプティカルフローを使用して最初に記録されたフレームに対する各赤色フレームのモーションフィールドを計算し、双線形補間を使用して赤色と緑色の両方のフレームのモーションを補正しました。オプティカルフローモーション補正のアルゴリズムは、参考文献で以前に説明されています。 23. モーションフィールドの計算にオプティカルフローコンポーネントのみを使用し、フィーチャマッチング制約を省略しました。滑らかさを促進するために、モーションフィールドの勾配を正規化しました (λ = 800)。光学フローモーション補正 (ofco) パッケージの Python コードは、https://github.com/NeLy-EPFL/ofco にあります。

おそらく、インプラントによって右側に押される胸部臓器による散乱のため、絶対蛍光値は結合部の右側で左側よりもわずかに低いことが観察されました。この不均一な絶対蛍光を補正するために、時間にわたるすべての動き補正されたフレームの平均を計算しました。次に、結果の画像をメディアンフィルターとローパスフィルターにかけて (メディアンフィルター: (71,91)、ガウスフィルター: σ = 3)、個々のニューロンの特徴を除去し、蛍光の全体的な空間的変化のみを保持しました。次に、y 軸の平均を計算して、x (左 - 右) 軸の蛍光プロファイルを取得し、最も中央の 200 ピクセルに直線を当てはめました。右側に向かう蛍光の減少を補正するために、x 軸プロファイルに適合したこの直線の逆数値を蛍光に乗算しました。この補正は蛍光の可視化にのみ役立つものであり、特定のピクセルについて各時点の蛍光とそのベースライン蛍光の両方に同じ定数が乗算されるため、ΔF/F の計算には影響を与えないことに注意してください。要素。

登録および修正されたデータのノイズを除去するために、DeepInterpolation アルゴリズムの適応バージョンを使用しました75。簡単に説明すると、DeepInterpolation はニューロンネットワークを使用して、時間的に隣接するフレームから顕微鏡画像を「補間」することで、顕微鏡画像のノイズを除去します。 U-Net は、ターゲットフレームの前後 30 フレーム (約 2 秒) を入力として、現在のフレームを出力として使用して、教師なしの方法でトレーニングされます。したがって、独立したノイズが画像から除去され、時間の経過とともに動的に変化するコンポーネントが保持されます。トレーニング手順を変更して、1 つのバッチを Nvidia GTX 2080TI グラフィックスカードの 11GB RAM に収まるようにしました。フレーム全体 (352 × 576 ピクセル) を使用するのではなく、トレーニング中に画像のサブセット (352 × 288 ピクセル) を使用しました。サブセットの x 座標をランダムに選択しました。推論中に画像全体を使用しました。トレーニングと推論中に異なる画像サイズを使用しても、境界領域の外側で得られるノイズ除去された画像が変化しないことを確認しました。餌を与える前に、トライアルの 1 つからランダムに選択した 2000 フレームを使用してハエごとに 1 つのモデルをトレーニングし、それを後続のすべてのフレームに適用しました。トレーニングパラメーターの概要を表 1 に示します。適応された DeepInterpolation アルゴリズムは、次の GitHub リポジトリの「adapttoR57C10」ブランチにあります: https://github.com/NeLy-EPFL/deepinterpolation

蛍光値をΔF/Fとして示します（補足ムービー10〜12）。これは \({{\Delta }}F/F=\frac{F-{F}_{0}}{{F}_{0}}\) として計算されました。ここで、F は時間変化する蛍光、F0はピクセル単位の蛍光ベースラインです。 F0 を計算するために、空間ガウスフィルター (σ = 10) を画像に適用し、各ピクセルを 10 サンプルの時間ウィンドウ (約 0.6 秒) で畳み込みました。次に、すべての試行にわたって各ピクセルの最小蛍光を特定しました。

オプティカルフローセンサーは、球面トレッドミルの回転を測定するために使用されてきました 6,23 が、本質的にノイズが多くなります。したがって、80 個のサンプル (約 200 ミリ秒) にわたる移動平均を計算しました。前処理されたセンサー値から、前方、横方、旋回速度を計算しました6。静止期間 (ボールの動きがない期間) を、球面トレッドミルの回転速度の絶対オプティカルフロー値が閾値 \(0.31 {{{{{{{\rm{ms}}}}}) を下回る期間として分類しました。 }}}^{-1}\widehat{=}0.01\) 回転/秒であり、サンプルの時間 ± 0.5 秒以内のフレームの少なくとも 75% がこのしきい値を下回っていました。後者の基準では、歩行の合間の短い静止期間が除外されることが保証されました。

3 つの異なるデータモダリティを 3 つの異なるサンプリング周波数で記録しました。2 光子イメージングデータは約 16 Hz で記録され、7 台のカメラからの挙動画像は 80 Hz で取得され、2 つのオプティカルフローセンサーを使用したボールの動きはほぼ 400 Hz で測定されました。したがって、さらなる分析のためにこれらの測定値を同期させるために、1 つの 2 光子フレーム中に取得されたすべての行動サンプルとボール回転サンプルを平均することにより、すべての測定値を 2 光子イメージングフレームレートにダウンサンプリングしました。

図4eに示すように、各トライアルの正規化された蛍光トレースを計算するために、子宮頸部結合全体にわたる蛍光を平均し、給餌前のトライアル中にこの時系列の99％パーセンタイルを計算しました。次に、そのハエから記録されたすべてのトライアルの時系列を、給餌前の 99% パーセンタイルまで正規化しました。統計分析を実行するために、正規化された蛍光を使用し、給餌前、給餌中、給餌後の特定の期間内の最大値 (99% パーセンタイルの上限) を計算しました。パーセンタイル正規化から予想されるように、摂食前、最大正規化蛍光は 9 匹のハエのそれぞれで 1 です。摂食中、摂食後<9分、摂食後<19分、摂食後<29分、および摂食後<38分の期間について、マン・ホイットニーU検定を実行して、カフェインを大量に摂取した後の最大神経活動が最大神経活動と有意に異なるかどうかを判定しました。スクロースまたは低カフェイン摂取後の活性（図4g）。必要最小限の量または前処理を適用することを目指して、この時点まで、DeepInterpolation を使用してノイズ除去されていない蛍光データを使用していました。ただし、この場合、波の正確なタイミングを分析するために、前述のように DeepInterpolation を適用しました。これにより、バックグラウンドの蛍光と高周波ノイズが減少します。蛍光波の時間的進行を分析するために、まず頸部結合 Tpeak 全体にわたる蛍光のピーク時間を特定しました。すべての時間は、正確なタイミングの違いを分析できるように、そのピークの時間を基準にして与えられます。次に、手動で選択した関心領域 (背側、側方、腹側結合、および巨大線維ニューロン) 内の経時的な平均蛍光を計算し、それらを最小値と最大値に正規化して表します。ガウスフィルター (\(\sigma=3\widehat{=}0.18\) s) を使用して時系列を平滑化しました。各ピクセルのピーク時間を特定するために、時間ガウスフィルター (\(\sigma=10\widehat{=}0.62\) s) と空間ガウスフィルター (σ = 1) を適用し、Tpeak 内の最大蛍光値を検索しました。 ±10秒。図4fでは、ハエが静止している（つまり、ボールを動かしていない）期間中の平均蛍光を示しています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成された生データは、https://dataverse.harvard.edu/dataverse/long_term_imaging_vnc_drosophila で利用できるパブリックリポジトリに保管されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

生データの分析に使用されるカスタムコードは、https://github.com/NeLy-EPFL/Long-Term-Imaging-VNC-Drosophilahttps://doi.org/10.5281/zenodo.6826488 から入手できます。

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移植された動物の写真とビデオを提供してくれた Alain Herzog に感謝します。 LH は、EU H2020 Marie Skłodowska-Curie 助成金 (754354) からの支援を認めます。 JB は、ベーリンガーインゲルハイム財団の PhD 奨学金からの支援に感謝します。 VLR は、助成金番号 709993 の下で、メキシコ国家科学技術評議会 CONACYT からの支援を認めています。SG は、EPFL SV iPhD Grant からの支援を認めています。 FA はベーリンガーインゲルハイム財団の PhD 奨学金からの支援を認めています。 MSS は、欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラム (助成契約番号 714609) に基づく欧州研究評議会 (ERC) からの支援を認めています。 PR は、SNSF プロジェクト助成金 (175667) および SNSF Eccellenza 助成金 (181239) からの支援を認めます。

これらの著者は同様に貢献しました: Laura Hermans、Murat Kaynak。

EPFL、ブレインマインド研究所および生物工学研究所、神経工学研究所、ローザンヌ、スイス

ローラ・ハーマンズ、ジョナス・ブラウン、ビクター・ロバト・リオス、チンリン・チェン、アダム・フリードバーグ、セミ・ギュネル、フロリアン・アイマンズ、パヴァン・ラムディア

微生物工学システム研究所、機械工学研究所および生物工学研究所、EPFL、ローザンヌ、スイス

ローラ・ハーマンズ、ムラット・カイナック、マフムート・セルマン・サカール

コンピュータービジョン研究所、EPFL、ローザンヌ、スイス

セミ・グネル

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LH - 概念化、方法論、ソフトウェア、検証、形式分析、調査、データ収集、データキュレーション、執筆 - 元の草案の準備、執筆 - レビューと編集、視覚化。 MK - 方法論、ソフトウェア、検証、形式分析、執筆 - オリジナル草案の準備、執筆 - レビューと編集、視覚化。 JB - 方法論、ソフトウェア、形式分析、データキュレーション、ライティング - レビューと編集、視覚化。 VLR - 方法論、ソフトウェア、形式分析、データキュレーション、ライティング - レビューと編集、視覚化。 C.-LC - データ収集、データキュレーション、ライティング - レビューと編集 AF - 方法論、ライティング - レビューと編集 SG - 方法論、ソフトウェア、データキュレーション、ライティング - レビューと編集。 FA - 方法論、ソフトウェア、執筆 - レビューと編集。 MSS - 概念化、方法論、リソース、執筆 - オリジナル草案の準備、執筆 - レビューと編集、監督、プロジェクト管理、資金調達。 PR - 概念化、方法論、リソース、執筆 - オリジナル草案の準備、執筆 - レビューと編集、監督、プロジェクト管理、資金調達。

マフムート・セルマン・サカールまたはパヴァン・ラムディアへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Davide Raccuglia と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Hermans、L.、Kaynak、M.、Braun、J. 他。マイクロエンジニアリングされたデバイスにより、行動する成体ショウジョウバエの腹側神経索の長期画像化が可能になります。 Nat Commun 13、5006 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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受信日: 2021 年 11 月 13 日

受理日: 2022 年 8 月 4 日

公開日: 2022 年 8 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32571-y

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